J Exp Med：烟酰胺单核苷酸转移酶（NNT）通过维持Fe-S酶功能而调节NSCLC线粒体代谢

人类文明白血病展现不止强大而有用的肝细胞激素，显然是由肝组织的高氧普遍性导致的。由于降解(ROS)的降解是这种激素的副副产物，因此须要以特罗斯季亚涅齐腺嘌呤二核苷硫磷硫(NADPH)的形式来减低硫硫应激，以应付这种肝细胞活普遍性的消退。特罗斯季亚涅齐单核苷硫转移复合物(NNT)可通过NADPH的降解来确保肝细胞的抗硫硫意志力，但其在非小细胞膜白血病(NSCLC)里面的起到尚未明确。本研究找到NNT的解读在白血病激素数学模型里面明显消退了的构成和洪水泛滥普遍性。另外，再进一步研究找到NNT局限普遍性则会造成了肝细胞功能普遍性障碍，这与硫硫应激的大量降低毫无关系，而是以核糖核酸细胞膜内的活普遍性减低为字样。这些局限普遍性与NADPH的有效普遍性和ROS的积攒有关，这暗示NNT在过重这些更为重要细胞膜内丝氨酸的硫硫里面起着更为重要起到。

新方法

许多类似于的白血病激素数学模型是借助C57BL6/J激素的家养策略而构建。寻常的是，这些激素载有纯合碱基7-11的左上角局限普遍性以及肝细胞里面Nnt基因序列的错义凋亡造成了非功能普遍性细胞膜内的解读。因此，可以借助这种自然局限普遍性的遗传(NntΔex7-11)来高度评价NNT对白血病起因的阻碍。

首先，常用Kras凋亡(LSL-KrasG12D/+)引致的白血病数学模型来检验Nnt解读对白血病起因的阻碍。载有Cre整合复合物的腺免疫缺陷LSL-KrasG12D/+激素，可诱导KrasG12D在肝上皮里面的解读和肝膀胱癌的构成。借助LSL-KrasG12D/+激素和C57BL6/J激素交配导致Nnt+/+解读激素或NntΔex7-11/Δex7-11解读激素(上图1A-1B)。该数学模型里面Nnt的解读造成了Cre整合复合物出现异常的损耗加快3个月(上图1C-1D)。然后，借助Kras凋亡与p53局限普遍性同时解读(LSL-KrasG12D/+；Trp53flox/flox，也称为KP)构建白血病数学模型。Nnt的解读无法偏离Cre诱导的KP激素的%-(上图1E)。寻常的是，在这个数学模型里面，p53的局限普遍性去除了Nnt解读对白血病构成的阻碍，并且无论Nnt解读如何，实验者最终都普遍存在明显的损耗(上图1F)。白血病损耗百分比的取样在各有不同基因型激素之间无法区别(上图1G-1H)。

虽然各有不同基因型激素之间的损耗无法区别，但显然判读到数学模型里面洪水泛滥普遍性的区别。我们找到Nnt+/+激素里面51.3%的为3级(膀胱癌)或以上，而NntΔex7-11 / +和NntΔex7-11 /Δex7-11激素里面均36.5%和38.8%的是高级(上图1I)。Nnt+/+激素起因4级的频率很大降低，归功于洪水泛滥普遍性的变化(上图1J)。总之，这些信息暗示Nnt增进了白血病的起因和洪水泛滥。

2 NNT的局限普遍性不阻碍肝细胞里面硫氧还细胞膜内(TXN)的抗硫硫体系

为了再进一步分析报告NNT对白血病分子生物学的阻碍，首先分析报告shRNA依赖普遍性NNT细胞膜内的解读，包括4个解读NNT细胞膜内的NSCLC细胞膜系 (A549, H1299，H2009和PC9)和不解读NNT细胞膜内的H441细胞膜(上图2A)。依赖普遍性NNT细胞膜内解读抑制NSCLC细胞膜的增殖意志力(上图2B)。并且找到较慢免疫缺陷4天后NNT的下调减低了H2009和PC9细胞膜的生存意志力(上图2C)。此外，H441细胞膜的增殖都受NNT的阻碍。

通常确信NNT有助于NADPH的衍生物意志力，从而确保肝细胞细胞膜内抗硫硫系统设计处于衍生物完全(上图2D)。依赖普遍性NNT减低了H1299、H2009和PC9细胞膜里面NADPH: NADP+的百分比 (上图2E)。较慢免疫缺陷4天后肝细胞里面H2O2很大降低(上图2F)，所以NNT对H2O2利尿每一次很不可或缺。

为了确认这些肝细胞ROS的降低否与肝细胞抗硫硫系统设计有关，于是借助Western blotting分析报告肝细胞里面过硫硫物细胞膜内3(PRDX3)的硫硫完全。H2O2通过PRDX3利尿，即一对半胱氨硫底物诱导PRDX3构成二聚体，并且必须通过TXN衍生物这些半胱氨硫底物才能衍生物PRDX3的抗硫硫功能普遍性。PRDX3二聚体的积攒是PRDX3硫硫的字样，是肝细胞硫硫应激的则会用字样物。

奥维特芬是一种TXN衍生物复合物(TRXR)药物，虽然奥维特芬的放射治疗则会造成了PRDX3细胞膜内大量硫硫，但NNT的局限普遍性并无法降低PRDX3的硫硫(上图2G)。此外，NNT的局限普遍性也无法减低肝细胞TXN2或TRXR2的细胞膜内程度。总之，这些结果暗示NNT在NSCLC细胞膜增殖意志力上体现不可或缺起到，但NNT活普遍性的完全恢复并不则会伤害肝细胞TXN抗硫硫系统设计，也不则会引致明显的硫硫应激。

3 NNT的局限普遍性则会伤害肝细胞的硫硫意志力

鉴于NNT在IMM里面的取向及其阻碍膜上质子数量级和衍生物意志力，于是试上图探讨NNT对肝细胞硫硫激素否不可或缺。首先，常用海马细胞膜外数量级统计分光透过肝细胞压力检验，分析报告NNT局限普遍性对一般肝细胞硫硫功能普遍性的阻碍。结果找到NNT局限普遍性细胞膜的耗氧量(OCR) 随肝细胞药物的依序传递而被下滑(上图3A)。值得一提的是的是，NNT局限普遍性细胞膜的最大痉挛意志力在不比如说非极化痉挛的情况很大减低(上图3B)。这提示肝细胞硫硫局限普遍性与NNT对质子梯度的阻碍毫无关系。鉴于NNT局限普遍性明显阻碍痉挛意志力，于是检验NNT局限普遍性的H441细胞膜否比NNT解读细胞膜有着更少的硫硫和更强的NADH意志力。这说明这些细胞膜在无法NNT的情况显然通过肝细胞NADPH来源而确保肝细胞的功能普遍性。

肝细胞的硫硫激素比如说ETC的功能普遍性，ETC由诱导电子传递的Fe-S细胞膜内蛋白均是由。受制于Fe-S细胞膜内蛋白的代谢每一次须要NADPH，于是研究NNT依赖普遍性后肝细胞痉挛功能普遍性的下滑否与Fe-S细胞膜内关的。肝细胞压力检验可以对痉挛功能普遍性透过一般普遍性的统计分析，但不可以对单个ETC蛋白化学成分透过分析报告。因此，原作者透过了并不大学本科的实验者来统计分析Fe-S细胞膜内依赖的痉挛关的蛋白(I, II, III)。结果找到，基于蛋白I(硫和苹果硫)的摄取，在NNT依赖普遍性后蛋白I-III的活普遍性很大减低(上图3C)。此外，NNT局限普遍性细胞膜明显减低了钻石硫的OCR，暗示减低了钻石硫脱氢复合物(SDH)活普遍性和蛋白II-III流量(上图3D)。造成了这一情况的不可或缺原因是SDH在ETC和TCA循环系统设计里面扮演双重角色。

除了通过ETC确保电子装置量外，Fe-S细胞膜内还确保对硫硫激素至关不可或缺的其他细胞膜内复合物的功能普遍性。为了确认NNT否参与其他Fe-S细胞膜内的功能普遍性，原作者分析报告了TCA循环系统设计里面Fe-S细胞膜内——顺藁本硫复合物(ACO2)的活普遍性。结果找到依赖普遍性NNT很大减低了NSCLC细胞膜系里面ACO2的活普遍性(上图3E)。ACO2活普遍性的减低显然则会损坏TCA循环系统设计，进而下滑驱动ETC流量的衍生物普遍性物质的降解。为了不足之处非小细胞膜白血病里面ACO2功能普遍性的统计分析，于是高度评价Nnt解读对KP白血病里面ACO2活普遍性的阻碍。结果暗示，Nnt+/+激素里面Aco2活普遍性明显很低NntΔex7-11/+ 和NntΔex7-11/Δex7-11里面的，缺乏Nnt的展现不止最高的活普遍性(上图3F)。

4 外源普遍性NADPH在NNT局限普遍性后确保Fe-S细胞膜内功能普遍性

为了确认与依赖普遍性NNT关的的肝细胞Fe-S细胞膜内功能普遍性的减低否与NADPH:NADP+的减低有关，我们试上图提供者一种肝细胞NADPH的外源普遍性来源。为了实现这一期望，我们考虑了蛋白酶肝细胞里面NADH激复合物pos5p，它可以磷硫化NADH而导致NADPH。虽然pos5p以前在细菌里面也有外源解读，但据我们鲜为人知，pos5p还无法被替换成哺乳动物系统设计。为了检验我们否能够体现作用在人类文明NSCLC细胞膜的肝细胞里面解读pos5p细胞膜内，我们对蛋白酶细胞膜内透过了修饰，使其包含HA-tag。Western blot结果显示，在H1299、H2009和PC9细胞膜的肝细胞里面最终解读了HA-tag标记的pos5p细胞膜内(上图4A)。考虑这些细胞膜系是为了分析报告pos5p整修和NNT局限普遍性关的的Fe-S细胞膜内局限普遍性的意志力，找到依赖普遍性NNT后对它们导致很严重影响的阻碍。

pos5p的解读起死回生了细胞膜里面依赖普遍性NNT后引致的NADPH: NADP+百分比的下滑(上图4B)。这与解读pos5p细胞膜里面pos5p扰后痉挛支链有用活动的下滑有关(上图4C和4D)。此外，pos5p的解读完全起死回生了NNT依赖普遍性后ACO2活普遍性的下滑(上图4E)。总之，这些信息暗示确保NNT解读局限普遍性时NADPH的程度可以确保NSCLC细胞膜里面Fe-S细胞膜内的功能普遍性。

5 NNT的局限普遍性不则会损坏Fe-S细胞膜内的代谢

受制于肝细胞外源普遍性NADPH能够消退NNT局限普遍性关的Fe-S细胞膜内的局限普遍性，并且NADPH是高效确保Fe-S细胞膜内代谢的必备条件，因此我们再一试上图确认NNT活普遍性否确保这一每一次。Fe-S细胞膜内代谢起因在一个由半胱氨硫脱硫复合物(NFS1)和Fe-S中空细胞膜内(ISCU)均是由的多细胞膜内蛋白里面。蛋白里面任何一种化学成分的局限普遍性都则会阻碍代谢，并且也与肝细胞局限普遍性关的。因此，我们依赖普遍性NFS1或ISCU解读来研究损坏Fe-S细胞膜内代谢后对痉挛支链和ACO2的阻碍。

在H2009细胞膜里面，依赖普遍性NFS1后很大减低硫/苹果硫自由基和钻石硫自由基里面痉挛支链蛋白I-III的活普遍性，而在PC9细胞膜里面只有蛋白II-III活普遍性被明显减低(上图5A和5B)。另外，两个细胞膜系里面，在硫/苹果硫和钻石硫的起到下，依赖普遍性ISCU解读后很大消退了OCR(上图5A和5B)。并且依赖普遍性NFS1或ISCU后很大减低了细胞膜系里面ACO2活普遍性(上图5C)。寻常的是，NNT依赖普遍性后所引致的局限普遍性与Fe-S细胞膜内代谢所均需物质导致的局限普遍性是同等不可或缺的(上图5A-5C)。

为了证明Fe-S细胞膜内局限普遍性对NSCLC细胞膜的肝细胞激素有功能普遍性普遍性阻碍，我们对依赖普遍性NNT或ISCU细胞膜透过基于液相色谱-高分辨质谱(LC-HRMS)的激素组学研究。 对这些细胞膜TCA循环系统设计的激素物透过统计分析，结果显示大多数里面间副产物的总质量起因了很大变化(上图5D)。这些都暗示了硫硫激素的严重影响损坏和Fe-S细胞膜内功能普遍性局限普遍性的一致普遍性。具体地说就是依赖普遍性NNT和ISCU解读后，硫、苹果硫和富马硫被耗尽。NNT局限普遍性细胞膜里面的柠檬硫程度被耗尽，但依赖普遍性ISCU细胞膜里面并无法此结果。另外，依赖普遍性ISCU细胞膜里面钻石硫大量积攒，而在NNT局限普遍性细胞膜里面则不普遍存在此情况(上图5D)。

除了Fe-S细胞膜内ACO2和SDH外，TCA循环系统设计还比如说另一种肝细胞Fe-S细胞膜内——硫辛硫衍生物复合物(LIAS)的功能普遍性。LIAS对于硫辛硫的衍生物以及不可或缺硫辛硫盐双键的共轭都并不更为重要，硫辛硫盐双键由PDH (E2)和α-胺戊二硫脱氢复合物(二氢硫辛酰胺S-钻石酰转移复合物，DLST)均是由。LIAS对Fe-S细胞膜内代谢的损坏特别寻常，因为其Fe-S簇在催化每一次里面被耗尽掉，这就尽快不断地透过细胞膜内交换。事实上，依赖普遍性NFS1和ISCU解读则会大量下滑PC9细胞膜里面PDH-E2和DLST的脂化，然而依赖普遍性NNT对细胞膜内脂化无阻碍(上图5E)。总的来说，这些信息暗示，NNT造成了复合物和激素局限普遍性，它们的局限普遍性与Fe-S细胞膜内代谢的损坏关的，但NNT不显然直接阻碍这一每一次。这反映不止依赖普遍性NNT和ISCU后对TCA循环系统设计导致类似但又各有不同的阻碍。

6 NNT的局限普遍性损坏脂肪硫激素

除了耗尽TCA循环系统设计外，NNT局限普遍性细胞膜的LC-HRMS激素组学统计分析暗示脂肪硫激素紊乱。依赖普遍性NNT增进长支链脂肪亚胺糖类的大量积攒，而长支链脂肪亚胺糖类是脂肪硫β-硫硫的底物(上图6A)。鉴于在NNT局限普遍性细胞膜里面普遍存在痉挛系统设计局限普遍性，我们推测这些亚胺糖类的降低是由于脂肪硫硫硫下滑。我们找到在H1299和PC9细胞膜里面OCR与棕榈树硫盐的硫硫有关，依赖普遍性NNT后OCR减低(上图6B)。我们还判读到NNT局限普遍性细胞膜里面饱和脂肪硫和不饱和脂肪硫均大量积攒(上图6C)。脂肪硫衍生物须要耗尽大量NADPH，而且NNT依赖普遍性后NADPH的有效普遍性减低，于是我们确信这些脂肪硫程度的降低是由于外源普遍性脂肪硫摄入的降低。另外，我们找到，NNT局限普遍性细胞膜消退了对白光棕榈树硫类似物的吸收意志力(上图6D)。为了高度评价NNT依赖普遍性后脂肪硫的积攒显然一个潜在的主因，我们常用饱和脂肪硫棕榈树硫酯诱导NNT局限普遍性细胞膜24小时，找到NNT依赖普遍性后使H1299和H2009细胞膜对棕榈树硫盐寻常(上图6E)。此外，NNT依赖普遍性后很大大大提高了H1299和PC9细胞膜对单一不饱和脂肪硫油硫盐的寻常普遍性(上图6F)。鉴于外源普遍性脂肪硫不足之处的有害阻碍，我们预计细胞膜外上皮细胞耗尽将确保NNT的局限普遍性。令人惊讶的是，蛋白酶菌里面的上皮细胞耗尽升温了NNT的下调(上图6G)。更不可或缺的是，NNT依赖普遍性后细胞膜外上皮细胞欠缺则会降低NADPH的耗尽(上图6H)，这暗示在缺乏外源普遍性脂肪硫的情况不得不衍生物脂肪硫，使NNT局限普遍性细胞膜里面NADPH的有效普遍性减低。总的来说，这些信息暗示NNT显然在调节脂肪硫激素里面起不可或缺起到，NSCLC细胞膜的脂肪硫激素紊乱显然是一个可借助的弱点。

7 NNT局限普遍性后肝细胞类似物过硫硫氢复合物(MitoCatalase)起死回生Fe-S细胞膜内功能普遍性

Fe-S细胞膜内对水分子氧和更多排泄物的硫硫并不寻常。虽然我们无法判读到肝细胞细胞膜内抗硫硫系统设计的硫硫完全起因变化，但这并不除去NNT依赖普遍性后造成了的肝细胞ROS充分将这些寻常普遍性丝氨酸硫硫。为了探究这种显然普遍性，我们常用了肝细胞类似物的过硫硫氢复合物(MitoCatalase)来消退肝细胞的抗硫硫意志力。我们最终地在H1299、H2009和PC9细胞膜里面过解读了MitoCatalase (上图7A)。MitoCatalase的解读也部份消退了NNT依赖普遍性后关的肝细胞里面H2O2的导致(上图7B)。这与NNT依赖普遍性后痉挛支链有用活动的下滑一般来说应(上图7C和7D)。另外，MitoCatalase的解读完全恢复NNT依赖普遍性后ACO2的活普遍性(上图7E)。综上所述，这些信息暗示，大大提高肝细胞利尿H2O2的意志力可以不致NNT依赖普遍性后Fe-S细胞膜内起因局限普遍性，从而使NNT在不致Fe-S细胞膜内起因硫硫方面体现起到，但对Fe-S簇的代谢无起到。

论据

总之，我们的研究暗示，NNT对白血病分子生物学有着不可或缺意义，主要是通过调控Fe-S细胞膜内而增进肝细胞激素。与以往高度评价NNT功能普遍性的研究各有不同，我们描述了NNT对NSCLC里面肝细胞硫硫衍生物稳态的暧昧阻碍。在NSCLC里面，NNT活普遍性显然过重了大量硫硫激素引致的硫硫应激自由基。我们的找到再进一步暗示了肝细胞激素在白血病起因里面的必要普遍性，说明肝细胞功能普遍性的消退显然是白血病放射治疗的一个不可或缺抗肿瘤。复合物TPH-1对脾确保起更为重要起到，显然作为放射治疗CKD的潜在放射治疗抗肿瘤。

原始不止处：

Ward NP, Kang YP, Falzone A, Boyle TA, DeNicola GM. Nicotinamide nucleotide transhydrogenase regulates mitochondrial metabolism in NSCLC through maintenance of Fe-S protein function.J Exp Med (IF: 10.892). 2020 Jun 1;217(6):e20191689. doi: 10.1084/jem.20191689.