A traditional medicine, respiratory detox shot (RDS), inhibits the infection of SARS-CoV, SARS-CoV-2, and the influenza A virus in vitro
Brian Hetrick1, Dongyang Yu2, Adeyemi A. Olanrewaju1, Linda D. Chilin1, Sijia He1, Deemah Dabbagh1,Ghaliah Alluhaibi1, Yuan - Chun Ma3, Lewis A. Hofmann4, Ramin M. Hakami1 and Yuntao Wu1*
▋简要
历史背景：在此之前于是以为患全球的新型亚型感染者病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个第三世界和南部大流行，截至 2021 年 4 年底已导致高达 1.28 亿人感染者，高达 280 万人生还。当前，不得而知可必要减少 COVID-19 无故率的治疗法工具。我们研究者了一种宗教性的中的药口服抗生素——融肺毒口服液 (RDS) 的潜在抑止亚型感染者来生性，该口服液主要掺入为我国地区医学宗教性中的用作治疗法肺部哮喘的中的药用植物。
结果：RDS 具体联 SARS-CoV 比较慢免疫缺陷者、SARS-CoV-2 比较慢免疫缺陷者、结合猪流感免疫缺陷者-SARS-CoV-2(Ha-CoV-2) 真型免疫缺陷者以及传染性 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 混种免疫缺陷者 (B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.429、B.1.2、B.1.494、B.1.1.207、B.1.258 和 B.1.1.298) 对外源内的感染者。我们必要性断定 RDS 可以反之亦然灭来生 SARS-CoV-2 免疫缺陷者表面的传染性。此外，我们断定 RDS 还可切断猪流感猪流感免疫缺陷者对外源内的感染者。
推论：RDS 可为广泛具体联呼用者道免疫缺陷者感染者。关键词：SARS-CoV-2，COVID-19，亚型感染者，抑止免疫缺陷者治疗法，融肺毒口服液，宗教性中的药，SARS-CoV，猪流感猪流感，Ha-CoV-2，SARS-CoV-2 真型免疫缺陷者
▋历史背景
在此之前于是以为患全球的新型亚型感染者病 (SARS-CoV-2) 已在 220 多个第三世界和南部大流行，截至 2021 年 4 年底已导致高达 1.28 亿人感染者，高达 280 万人生还。当前，不得而知可必要减少 COVID-19 无故率的治疗法工具。新成现的 COVID-19 免疫缺陷者致病为亚型感染者 SARS-CoV-2[1]，是 SARS-CoV 在情况下严重急性呼用者综合征具体亚型感染者种类中的的姊妹免疫缺陷者[2,3]。SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 最初都是在中的国断定的；SARS-CoV 免疫缺陷者于 2002 年 11 年底在广东省首次被断定[4-6]，SARS-CoV-2 则于 2019 年 12 年底在武汉首次被断定[1,7,8]。在中的国，这两次由亚型感染者造成的疫情中的，中的药原则上被为广泛采用，用以救护车应对亚型感染者造成的哮喘。对于当前的 COVID-19 大流行，中的国有高达 85% 的 SARS-CoV-2 感染者患者不感兴趣了宗教性中的医药治疗法（9，10）。许多采用的中的药是否是很强必要的抑止亚型感染者属性并在流行病学上是否是必要，这个重要缺陷尚已经取得充分对此。
中的药作为治疗法亚型感染者所造成了哮喘的必要治疗法，但由于忽视体内或粘液的系统对研究者，其转型与合理采用原则上受到了受阻。为了已确定中的药的潜在抑止 SARS-CoV-2 来生性，我们从常用中的药中的配对了多种药用植物大豆，并从中的药口服液 RDS(澳大利亚一种一些公司食品美国食品药品监督管理局) 中的断定了抑止 SARS-CoV 和抑止 SARS-CoV-2 免疫缺陷者的来生性，一种在澳大利亚的商业食品美国食品药品监督管理局。RDS 用作减弱生理呼用者系统对的总体健康，其包计有多种药用植物掺入，如当归和荆芥，它们是宗教性上用作高度集中上皮细胞和肺部哮喘的中的药用植物 (11-13)。在此，我们报导 RDS 对 SARS-CoV、SARS-CoV-2 真免疫缺陷者以及很强感染者性的野生型 SARS-CoV-2 免疫缺陷者对外源内的感染者很强具体联关键作用。我们必要性断定 RDS 可通过反之亦然灭来生免疫缺陷者表面或解救免疫缺陷者侵入而具体联免疫缺陷者的现代感染者工作进展。此外，我们断定 RDS 还可以解救甲流免疫缺陷者对外源内的感染者。这些相比较，RDS 对呼用者道免疫缺陷者的感染者不太可能很强为广泛的具体联关键作用。
▋结果
为了从宗教性中的药用植物中的找到潜在的抑止 SARS-CoV-2 来生性，我们从平均四十种宗教性药用植物中的配对提取成 SARS-CoV-2S 细胞真型比较慢免疫缺陷者[14,15] 和生理肺部 A549(ACE2) 外源内，此本能 ACE2 遗传物质会通过比较慢免疫缺陷者转导作为适配诱导，从而安定转导来缺少超表示。比较慢真型免疫缺陷者采用绿色激光细胞 (GFP) 或激光素酶 (Luc) 作为报导遗传物质，并通过了很强广谱抑止免疫缺陷者进入具体联剂，以及萨拉格拉 (Arbidol)[16]，和本能抑止毒血清抵抑止 SARS-CoV-2(左图 1a、C) 的于是以确性。我们必需顺利侦测到萨拉格拉 (Arbidol) 和抑止毒血清对于 SARS-CoV-2 真型免疫缺陷者的具体联关键作用，这是我们在其他四十余种宗教性药用植物大豆检验中的很难断定的，仅限于其中的一些忽视于较高有毒的药用植物 (左图 1a-C)。然而，鉴于比较慢性真型免疫缺陷者仅能侦测 SARS-CoV-2 免疫缺陷者的侵入犯罪行为，我们不能意味著这些药用植物大豆不太可能有在进入后阶段必需具体联 SARS-CoV-2 的不太可能性。我们必要性从宗教性抑止生素融肺毒口服液 (RDS) 中的配对成了不太可能的抑止 SARS-CoV-2 来生性，该复刻版产品成份九种药用植物掺入——、黄连、当归、荆芥、柴胡、苦杏仁、蜂房、皂角、绿叶，在中的国宗教性上用作治疗法肺部哮喘 (11-13)。
成份烷基咖啡醇和、3，4-二邻咖啡吡啶奎宁醇和、烷基 3，4-二邻咖啡吡啶奎宁醇和、原儿茶醇和、烷基绿原醇和和木犀草素；三叶中的还成份酰 A、B 和 10 种已知环酰醚萜酰[17]；该寄生植物还成份皂补血补血 A 和 B，以及抑止上皮细胞关键作用的酰 C[18,19]。黄连酯酰中的成份木脂素、松脂醇和和黄连酰[20]。当归中的成份被专指当归皂酰的甾体皂酰，是当归科寄生植物独有的寄生植物化学物[21,22]。紫花荆芥中的主要来生性掺入为四种单萜，(−)-薄荷酚、(+)-普莱格酚、(−)-柠檬酰和 (+)-薄荷甲苯；这种寄生植物还成份其他氟化物，如 1-辛酰-3-醇和、3-辛酚、β-年底桂酰和β-石竹酰[23]。柴胡成份高达 162 种氟化物，仅限于环酰醚萜和环酰醚萜酰、苯丙酰、有机醇和、龙涎香、果糖、黄酚类、和皂酰[24]。苦杏仁中的成份共通物、乙酰氟化物和果胶多糖[25]。皂角刺中的成份皂酰和羽扇豆醇和[26,27]，而绿叶中的成份主要来生性掺入绿叶醇和[28]。为了必要性检验 RDS 的抑止 SARS-CoV-2 来生性，用不同溶解溶解度的 RDS 示例 A549(ACE2) 细胞内，然后让这些细胞内在忽视于 RDS 的情况下不感兴趣 4-6 时长的感染者。感染者后，在不忽视于 RDS 的情况下培育成细胞内，然后在 48 和 72 时长的时候，通过流的单细胞内心法对免疫缺陷者感染者的具体联关键作用顺利完成量化。为了高度集中细胞内有毒，采用钴丙啶 (PI) 对即将生还和已生还的细胞内顺利完成切片，仅在来生细胞内群中的归纳 GFP+细胞内。如左图 2 右图，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV-2(GFP) 真免疫缺陷者很强口服具体联具体联关键作用。为了确认这些结果，我们采用内源性表示 ACE2 的 VeroE6 细胞内减法了该感染者试验中。
(不知下页左图)
ACE2 内外表示，在短期内 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 免疫缺陷者可对其顺利完成感染者，ACE2 并不一定用作亚型感染者的研究者 (7)。难以缺少在忽视 ACE2 超表示 [15，29，30] 的情况下，真型免疫缺陷者对 VeroE6 的感染者性较低，我们还采用了激光素酶报导遗传物质真型免疫缺陷者，该免疫缺陷者的报导遗传物质表示由 HIV-1LTR 和 Tat 驱动，很强更高的报导遗传物质特异性和信噪比。
左图 2：RDS 具体联 SARS-CoV-2(GFP) 真型免疫缺陷者感染者 A549(ACE2) 细胞内。
A.A549(ACE2) 细胞内用 RDS 不间断溶解 30 分钟后，用 SARS-CoV-2(GFP) 真型免疫缺陷者感染者。将细胞内沾去免疫缺陷者和 RDS，并在不忽视于 RDS 的情况下顺利完成培育成。流的单细胞内璇侦测免疫缺陷者感染者具体联情况下。已经感染者的细胞内和感染者 SARS-CoV-2(GFP) 但已经经 RDS 治疗法的细胞内作为相异。GFP+细胞内一般而言已显示。(PI) 钴丙啶。
B.RDS 的细胞内有毒系统性。A549(ACE2) 细胞内用 RDS 不间断溶解 4 时长，沾去 RDS，无 RDS 培育成 48 时长。钴丙啶切片鉴定即将生还细胞内和已生还细胞内，流的单细胞内心法归纳。素描口服-加在成细胞内有毒切线，RDS 的半无故溶解度 (LC50) 人口比例为 1:11.9。
如左图 3A 右图，我们采用 Luc 统计数据遗传物质真免疫缺陷者和 VeroE6 细胞内顺利完成感染者试验中，捕捉到到 RDS 对该免疫缺陷者感染者很强口服具体联具体联关键作用，并且总数具体联溶解度已确定为 1:230RDS 溶解度 (左图 3B)。我们还量化了 RDS 对 VeroE6 细胞内来生力的影响，已确定了 50% 细胞内生还口服为 1:11.8RDS 溶解度。
左图 3：RDS 对 SARS-CoV-2(Luc) 真免疫缺陷者和野生型 SARS-CoV-2 免疫缺陷者的口服具体联具体联具体联关键作用。用 RDS 不间断溶解示例 A、BVeroE6 细胞内，并用 SARS-CoV-2(Luc) 真型免疫缺陷者感染者。将细胞内沾去免疫缺陷者和 RDS，并在不忽视于 RDS 的情况下顺利完成培育成。在感染者后 72 时长用激光素酶侦测免疫缺陷者感染者的具体联关键作用。已经感染者细胞内和 SARS-CoV-2-luc 感染者但已经经过 RDS 治疗法的细胞内作为相异。试验中减法三次。素描口服加在成切线和 RDS 的 I-C50 溶解人口比例为 1:230。CRDS 对 VeroE6 细胞内的细胞内有毒也通过钴丙啶切片和流的单细胞内心法系统性。用 RDS 不间断溶解 4 时长，沾去 RDS，在不计有 RDS 的情况下培育成 72 时长。素描细胞内有毒口服-加在成切线，RDS 的半无故溶解度 (LC50) 人口比例为 1:13.8 溶解。DRDS 具体联传染性 SARS-CoV-2 感染者。用不间断溶解的 RDS 示例 VeroE6 细胞内，并在 RDS 忽视于的情况下感染者 SARS-CoV-2。感染者 48 时长后，通过暴菌斑归纳免疫缺陷者释放后的免疫缺陷者遗传物质具体联情况下。具体联次测试一的单内中顺利完成，并在 Prism7(Graph Pad) 中的采用单向于是以态分布 (One-Way ANOVA) 归纳及 Dunnett 后检验 (Dunnett's Post Test)，以此已确定总和显着性。显著性值用下标表示如下：*p
为了必要性于是以确性采用真免疫缺陷者取得的结果，我们检验了 RDS 对于 SARS-CoV-2 感染者的切断传染性能力。如左图 3D 右图，RDS 同时也切断了 SARS-CoV-2 对 VeroE6 细胞内的感染者。RDS 在溶解 1:40 以上时可显著减少免疫缺陷者突起的产生。
综上，通过 SARS-CoV-2 真免疫缺陷者与传染性免疫缺陷者的相比较，RDS 成份具体联 SARS-CoV-2 感染者的来生性掺入，不太可能是通过反之亦然灭来生免疫缺陷者或切断免疫缺陷者的现代感染者工作进展。
为必要性研究者不太可能的的系统对，我们将传染性 SARS-CoV-2 免疫缺陷者表面与不间断溶解的 RDS 在 37°C 下预培育成 1 时长。随后，将氢氧化钠必要性分别为溶解-(10–1 至 10–4)，并加在入 Vero 细胞内顺利完成暴菌斑归纳以已确定免疫缺陷者感染者性的减少。如左图 4A 右图，我们捕捉到到在 RDS 中的短暂暴露一时长后的免疫缺陷者表面，其 SARS-CoV-2 的感染者效价也方形口服具体联减少。该结果确认了 RDS 可必要反之亦然灭来生 SARS-CoV-2 免疫缺陷者表面的传染性。
我们必要性检验了 RDS 是否是也能具体联 SARS-CoV-2 免疫缺陷者混种的感染者。为此，我们利用已经有开发的结合甲免疫缺陷者-SARS-CoV-2 真型免疫缺陷者 (Ha-CoV-2)[31] 来氢化一复刻版 S 细胞值得注意，仅限于英国值得注意 (B.1.1.7)，南非值得注意 (B.1.351)，哥伦比亚值得注意 (P.1)，加在州值得注意 (B.1.429)，和其他几个新兴值得注意 (B.1.2，B.1.494，B.1.1.207B.1.258，B.1.1.298)。Ha-CoV-2(Luc) 和具体 S 细胞个体差异体在 37°C 不间断溶解 RDS 培育成 1 时长。随后，用该氢氧化钠感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 外源内。感染者后 12 时长，激光素酶推算成免疫缺陷者感染者的具体联关键作用。如左图 4B 右图，我们还捕捉到到了 RDS 对 Ha-CoV-2(Luc) 和所有 S 细胞值得注意的口服具体联具体联。
我们还检验了 RDS 切断 SARS-CoV 感染者的能力，采用略带 SARS-CoV 突刺细胞的 GFP 报导遗传物质比较慢免疫缺陷者和[15] 伪口服。我们将人 A549(ACE2) 细胞内用作外源内，将其用复刻版溶解的 RDS 示例，然后用 SARS-CoV(GFP) 统计数据遗传物质真免疫缺陷者感染者 4-6 时长。感染者后在不计有 RDS 的情况下培育成细胞内，流的单细胞内心法量化侦测其对免疫缺陷者感染者的具体联关键作用。同样，采用钴丙啶意味著即将生还与已生还的细胞内，仅在来生细胞内群中的归纳 GFP+细胞内。如左图 5A 右图，我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(GFP) 真型免疫缺陷者的具体联关键作用方形口服具体联。我们必要性确认了这些结果，并量化了 RDS 诱导的具体联与 Luc 报导遗传物质 SARS-CoV 真型免疫缺陷者，SARSCoV(Luc)。我们捕捉到到 RDS 对 SARS-CoV(Luc) 和的具体联关键作用方形口服性忽视，其半具体联溶解度 (IC50) 为 1:70.88 溶解度 (左图 5B，C)。难以缺少 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 都采用 ACE2 感染者外源内，我们还检验了 RDS 的抑止免疫缺陷者来生性是否是仅针对与 ACE2 有相互关键作用的亚型感染者。为此，我们侦测了一种不具体的负链 RNA 免疫缺陷者---猪流感猪流感免疫缺陷者。它通过免疫缺陷者血凝素 (HA) 和细胞内α-唾液醇和来感染者外源内。为了氢化猪流感猪流感免疫缺陷者，将表示猪流感猪流感 A/WSN/33(H1N1) 测序每个录像的 8 个适配和一个 GFP-报导遗传物质一共转染到 HEK293T 细胞内中的。在 RDS 忽视于的情况下，搜罗免疫缺陷者表面并用作感染者能够 MDCK 细胞内。如左图 6A 右图，我们捕捉到到 RDS 对猪流感猪流感免疫缺陷者的具体联关键作用方形口服具体联。RDS 在 1:40 和 1:80 溶解时可完全切断免疫缺陷者感染者，在 1:160 溶解除此以外可部分具体联猪流感猪流感。RDS 对 MDCK 细胞内的半无故溶解度 (LC50) 经推算成为 1:18.5(左图 6B)。这些相比较，RDS 的抑止免疫缺陷者来生性并非针对特定免疫缺陷者，而不太可能必需为广泛具体联多种呼用者道免疫缺陷者，如亚型感染者和猪流感猪流感免疫缺陷者。
▋辩论
在本统计数据中的，我们断定宗教性抑止生素融肺毒口服液 (RDS) 成份广谱抑止免疫缺陷者来生性，可切断 SARS-CoV、SARSCoV-2 和猪流感猪流感免疫缺陷者的感染者。虽然 RDS 必需具体联多种免疫缺陷者，但其抑止免疫缺陷者来生性因免疫缺陷者各种类型和传染病而异。例如，对 SARS-CoV 比较慢真免疫缺陷者的 I-C50 溶解度为 1:7.9 溶解度，对 SARS-CoV-2 比较慢真免疫缺陷者的 I-C50 溶解度为 1:230 溶解度。对于传染性野生型 SARS-CoV-2 免疫缺陷者，I-C50 为 1:40 溶解度，对猪流感猪流感，其 I-C50 为 1:250。RDS 对 Ha-CoV-2 及其混种有不同的具体联关键作用，IC50 数值从 1:70 到 1:2601 溶解度不等 (左图 4B)。
(不知下一页左图)
左图 4 RDS 对 SARS-CoV-2 和共通的 Ha-CoV-2 混种很强口服具体联灭来生关键作用。ASARS-CoV-2 表面加在不间断溶解的 RDS 在 37°C 下培育成 1 时长。随后，将氢氧化钠必要性不间断溶解，并加在入 Vero 细胞内中的顺利完成暴菌斑归纳，以已确定免疫缺陷者感染者性减少。具体联次测试一的单内中顺利完成，并在 Prism7(GraphPad) 中的采用单向于是以态分布 (One-WayANOVA) 归纳和 Dunnett 后检验 (Dunnett'sPostTest) 以此已确定总和显着性。显著性值用下标表示如下：*p
BHa-CoV-2(Luc) 和具体 S 细胞值得注意与不间断溶解的 RDS 在 37°C 培育成 1 时长后，用氢氧化钠感染者 HEK293T(ACE2/TMPRESS2) 外源内。感染者后 12 时长，激光素酶推算成免疫缺陷者感染者的具体联关键作用。RDS 的 IC50 值的溶解度为 1:177(wt)，1:828(B.1.1.7)，1:124(B.1.351)，1:88(P.1)，1:134(B.1.1.207)，1:2601(B.1.1.298)，1:70(B.1.258)，1:362(B.1.429)，1:163(B.1.494)，1:137(B.1.2)。
我们必要性断定 RDS 可以具体联亚型感染者的现代感染者工作进展。虽然具体的抑止免疫缺陷者的系统对尚已经清楚，但 RDS 可以通过反之亦然灭来生免疫缺陷者表面或通过解救免疫缺陷者侵入或切断免疫缺陷者侵入后的现代工作进展来解救免疫缺陷者感染者。在其他几种宗教性中的药中的也断定了抑止 SARS-CoV 和 SARS-CoV-2 的来生性。例如，一种罕不知的宗教性中的药——绿叶。
绿叶根中的已断定成份绿叶醇和素，可具体联 SARS 免疫缺陷者[32] 流行病学剥离株的遗传物质。此外，另一种可用作治疗法呼用者道哮喘的中的药——双黄连抗生素，已显示成在粘液以口服具体联方的单具体联 SARS-CoV-23CL 细胞酶 (3CLpro) 来生性。悬钩子酰和悬钩子素拟作为双黄连切断 3CLpro[33] 的必要掺入。
左图 5 RDS 具体联 SARS-CoV 真型免疫缺陷者对 A549(ACE2) 细胞内的感染者。用不间断溶解的 RDS 示例 A、B 细胞内，用 SARS-CoV(GFP)(A) 或 SARSCoV(Luc)B 真型免疫缺陷者感染者。将细胞内清沾，除去免疫缺陷者和 RDS，在不忽视于 RDS 的情况下顺利完成培育成。在感染者后 48 时长和 72 时长，通过流的单细胞内心法或激光素酶侦测来系统性免疫缺陷者感染者的具体联关键作用。试验中减法三次。素描口服响应切线，并素描 RDS 的 IC50 值为 1:70.9 溶解度 (C)
左图 6 RDS 具体联甲流免疫缺陷者对 MDCK 细胞内的感染者。(A) 用不间断溶解的 RDS 示例 MDCK 细胞内 30 分钟，然后用甲流免疫缺陷者 (GFP) 对其顺利完成感染者。感染者后，在 RDS 忽视于下培育成细胞内。36 时长后用流的单细胞内璇对免疫缺陷者感染者的具体联关键作用顺利完成系统性。把已经感染者的细胞内与被甲流免疫缺陷者 (GFP) 感染者但已经经 RDS 管控的细胞内顺利完成对比。左图中的显示了 GFP+细胞内的一般而言。PI 表示钴丙啶 PI。
(B) 另外还采用了 MTT 一原理系统性了 RDS 对 MDCK 细胞内的有毒，素描了细胞内有毒的口服-加在成切线，经计算，RDS 的总数无故溶解度为 1:18.5 溶解度 RDS 的必要抑止免疫缺陷者掺入尚已经已确定。然而，RDS 不同于悬钩子酰和悬钩子素，RDS 可以通过反之亦然灭来生免疫缺陷者光子来切断免疫缺陷者感染者 (左图 4)，而悬钩子酰和悬钩子素则在免疫缺陷者生命周期的后期通过切断免疫缺陷者细胞酶的来生性来发挥关键作用。然而，RDS 的粘液抑止 SARS-CoV-2 来生性仍需在今后的动物研究者和本能流行病学次测试中的取得确认。在此之前，我们即将顺利完成小型动物试验中，以已确定 RDS 在体内切断 SARS-CoV-2 免疫缺陷者感染者的潜力。
▋推论
我们的研究者说明了，RDS 可为广泛具体联呼用者道免疫缺陷者的感染者，如 SARS-CoV、SARS-CoV-2 和猪流感猪流感。
▋工具
细胞内和细胞内培育成
HEK293T (ATCC 巴里罗伊，弗吉尼亚) MDCK (ATCC 巴里罗伊，弗吉尼亚)，VeroE6 (ATCC 巴里罗伊，弗吉尼亚) 和 A549 (ACE2) (来自 Virongy LLC 赐与，巴里罗伊，弗吉尼亚)，和 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) (来自 Virongy LLC 赐与，巴里罗伊，弗吉尼亚) 在此之前保存于 Dulbecco's modifiedEagle's medium (DMEM) (赛默飞世尔新能源 Thermo Fisher Scientific) 成份 10% 热灭来生 FBS 和 1×青霉素-科里 (赛默飞世尔新能源 Thermo Fisher Scientific)。在 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞内培育成基中的分别以 1μg/ml 和 200μg/ml 的溶解度加在入嘌呤霉素和潮霉素 B。
线粒体转染和免疫缺陷者氢化
计有 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的比较慢性真型免疫缺陷者表面由 Virongy LLC (Manassas，VA) 给予，或按照末尾详细描述的工具[15] 氢化。简言之，为了氢化 GFP 报导遗传物质比较慢性真免疫缺陷者，HEK293T 细胞内与表示 SARS-CoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的适配、pCMVΔR8.2 和 pLKO.1-puro-TurboGFP 一共转染。为了产成激光素酶报导遗传物质比较慢性真型免疫缺陷者，将 HEK293T 细胞内与表示 SARSCoVS 细胞或 SARS-CoV-2S 细胞的适配、pCMVΔR8.2 和 pLTR-Tat-IRES-Luc 顺利完成一共转染。转染后 48 时长搜罗免疫缺陷者上清液，离心成品，−80℃ 保存。野生型 SARS-CoV-2 免疫缺陷者 (Isolate USA-WA1/2020) 由 BEI Bioresources (Manassas，VA) 给予。pHW-NAGFP (ΔAT6) 统计数据遗传物质线粒体和 A/WSN/1933 H1N1 共通线粒体 pHW2000-PB2、pHW2000-PB1、pHW2000-PA、pHW2000-HA、pHW2000-NP、pHW2000-NA、pHW20000M 由 FengLi 耶鲁大学友好关系给予。在猪流感免疫缺陷者 A-GFP 报导遗传物质光子氢化中的，将 pHW2000-pb2、pHW2000-pb1、pHW2000-PA、pHW2000-ha、pHW2000-np、pHW2000-na、pHW2000-m、pHW2000-ns 和 pHW-NA-GFP 一共转染 HEK293T 细胞内 (ΔAT6)。48 时长后搜罗免疫缺陷者上清液。SARS-CoV-2S、M、E、N 表示适配转售 Sinobiological。利用 Twist Bioscience 合成了 Ha-CoV-2(Luc) 适配和 S 细胞个体差异适配。Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞个体差异光子按照末尾详细描述工具[31] 顺利完成氢化。
免疫缺陷者感染者和抑止生素具体联次测试
RDS(融肺毒口服液)(来自 Dejia Harmony 赐与，利斯堡，弗吉尼亚) 是由马耶鲁大学试验中室 (Burnaby，BC，Canada) 生产的一种商业复刻版产品。RDS 中的所有中的药用植物掺入原则上相一致《中的国药典 2015 年版》「饮片」基准，仅限于必要掺入计有量及重金科、农药限量侦测。RDS 是一种中的药的一共蘸剂，终于游离在真空条件下融化。SARS-CoV-2 抑止血清由 LanceA. Liotta 医生给予。将萨拉朵尔盐醇和盐 (Sigma) 重新悬浮在二烷基亚砜 (Sigma) 中的。对于真型免疫缺陷者感染者，12 孔板中的的 A549(ACE2) 细胞内 (来自 Virongy LLC 赐与，巴里罗伊，弗吉尼亚) 或 VeroE6 细胞内用 RDS 示例 30 分钟，在 37℃ 下感染者 4-6 时长，然后在新鲜培育成基中的沾涤培育成 48-72 时长。对于 VeroE6 细胞内的感染者，细胞内也被 CoV-2 真型免疫缺陷者感染者减弱剂 (CoV-2PIE) (来自 Virongy LLC 赐与，巴里罗伊，弗吉尼亚) 示例后，在 37°C 下先管控 30 分钟。采用 GloMaxDiscover 酶标璇 (Promega) 归纳细胞内裂解物的激光素酶来生性。对于野生型 SARS-CoV-2 感染者，VeroE6 细胞内在 37°C 下用 RDS 示例 30 分钟，然后用 MOI 为 0.05 感染者 SARS-CoV-2 (Isolate USA-WA1/2020；BEI Bioresources) 在伊丽莎白沃恩所学校的 BSL-3 收容设施内驻留 1 时长。细胞内用 PBS 沾涤 2 次，用计有 RDS 的培育成基培育成 48 时长。从上清中的提取免疫缺陷者，用 12 孔板培育成的 Vero 细胞内单层中的的暴菌斑次测试推算成小瓶滴度。简言之，每个试样在零碎的 Dul-becco's ModifiedEagle 培育成基 (VWR) 中的氢化，包计有 1X 青霉素-科里 (VWR)，并移除在 10% 的 FBS(赛默飞世尔新能源 Thermo Fisher Scientific)。然后将 200 微升的每种溶解液用者附到 VeroE6 细胞内单层的三个平行孔上 1 时长。然后用 1～2 ml0.6% 里塔糖 (Invitrogen) 和一部分零碎的 Eagle Minimal Essential 培育成基 (VWR) 的氢氧化钠构成单层，计有 1X 青霉素-科里，并移除在 10%FBS。48 时长后，将单层膜通常在 10% 甲醛溶解中的 1 时长，并除去构成的里塔塞。为了切片突起，加在入成份 20% 乙醇和的 1% 成品紫染料溶解 5 分钟，然后用去离子水沾涤。对于猪流感猪流感免疫缺陷者感染者 MDCK 细胞内，在 37°C 下用 RDS 示例 30 分钟，然后用 A-GFP 报导遗传物质免疫缺陷者感染者 6 时长。用计有 RDS 的培育成基沾涤细胞内，培育成 36 时长。GFP 表示通过流的单细胞内璇系统性。(FACSCalibur，BD Biosciences).
对于 SARS-CoV-2 免疫缺陷者表面的 RDS 灭来生次测试，将 100μl 不间断溶解的 RDS 移除在到 1 mlSARS-CoV-2 免疫缺陷者原液 (3.65×105PFU/ml) 中的，终于 RDS 溶解为 1:20，1:40 或 1:80。也仅限于相异条件 (1 ml 免疫缺陷者+100μl 培育成基)。氢氧化钠在 37°C 下培育成 1 时长。随后，对氢氧化钠顺利完成复刻版溶解以产生额外的 1:10、1:100、1:1,000 和 1:10,000 溶解度，并将不间断溶解的试样加在入 12 孔板中的的 Vero 细胞内中的，用作顺利完成暴菌斑推算成归纳。突起推算成中的终于的 RDS 溶解度为 1:200 至 1:200,000；1:400 到 1:400,000；和 1:800 到 1:800,000 的 RDS 溶解液。
Ha-CoV-2(Luc) 和 S 细胞个体差异光子按照末尾详细描述的工具[31] 氢化。对于 Ha-CoV-2(Luc) 的 RDS 灭来生，将 5μl 不间断溶解的 RDS 移除在到 45μlHa-CoV-2(Luc) 或值得注意中的，终于 RDS 溶解度为 1:20、1:40、1:80、1:160 或 1:320。将氢氧化钠在 37°C 下培育成 1 时长，然后在 RDS 忽视于下感染者 HEK293T (ACE2/TMPRESS2) 细胞内 12 时长。采用 GloMax Discover 酶标璇 (Promega) 归纳细胞内裂解物的激光素酶来生性。
细胞内有毒归纳侦测
用钴丙啶切片和流的单细胞内心法量化对 A549 (ACE2) 细胞内和 VeroE6 细胞内的抑止生素细胞内有毒顺利完成侦测，如所述 (34)。采用细胞内增殖路易斯醇和盒 I(MTT) (Sigma) 和制造公司敦促的敦促书对 MDCK 细胞内的抑止生素有毒顺利完成量化。简言之，将 MDCK 细胞内 (ATCC) 以每孔 1×-105 个细胞内的速度水痘到 12 孔板中的。细胞内培育成隔夜后，通过 RDS 管控 1 天，然后在 MTT 标示出路易斯醇和 (Sigma) 的培育成基中的培育成。将细胞内与标示出路易斯醇和一共同培育成 4 时长，先后续加在入 MTT 增溶解。培育成皿孵育过夜，用 GloMax Discover 酶标璇 (Promega) 推算成用者亮度。
缩写
SARS-CoV：情况下严重急性呼用者系统对癫痫具体亚型感染者；SARSCoV-2：Severe 情况下严重急性呼用者系统对癫痫具体亚型感染者-2；TCM：宗教性中的药；RDS：呼用者道排毒口服液；Ha-CoV-2：结合猪流感新冠免疫缺陷者真免疫缺陷者。
来向
答谢 FengLi 给予猪流感免疫缺陷者表示适配，答谢 LanceLiotta 给予抑止毒血清；答谢 TedCi，HeSun，ZhigangGao，WanyingWu 的辩论与敦促；答谢 KevinCarter、MarkMamdar、RichKeurajian、KarenFreidouni 给予 RDS 和药用植物大豆。
作者贡献
此次试验中由 Y.W.，R.H. 和 L.A.H. 设计，由 Y.W. 撰稿，由 L.A.H. 校对。B.H.，D.Y.，A.A.O.，L.D.C.，S.H.，D.D、GA 及 YM 执行了该试验中。所有作者已读者并同意终于稿件。
资金投入
本研究者的资金来自于伊丽莎白沃恩所学校内外资助 223741(DeJiaHarmony/Anti-SARS-CoV-2)，该款项由德佳和畅 (DeJiaHarmony) 给予。
资料和材料的完整性
本研究者中的产生或归纳的所有资料原则上包计有在本文中的。路易斯醇和可从 Y.W 处获取。
公开信
同意及积极参与同意
不一般来说
同意撰写
不一般来说
竞争共同利益
伊丽莎白沃恩所学校第三世界生物城防和黄热病中的心的 RMH 和 YW 已取得了德佳和畅 (DejiaHarmony) 的研究者资助，LAH 为德佳和畅历任顾问并取得了酬金。很难其他关系或大型来生动不太会影响到敦促书的工作。
作者参考资料
1澳大利亚弗吉尼亚伊丽莎白沃恩所学校系统对生物学学院第三世界生物城防和黄热病中的心，巴里罗伊 20110。
2VirongyLLC，弗吉尼亚巴里罗伊。3加在拿大福纳比，BCV5J0E5 马耶鲁大学试验中室 (Dr.Ma's LaboratoriesInc.)。4 澳大利亚弗吉尼亚利斯堡世界卫生科学有组织，20176。
收稿日期：2021 年 4 年底 7 日
不感兴趣日期：2021 年 5 年底 10 日
线上撰写整整：2021 年 5 年底 29 日
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校对： 翟超男相关新闻
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